Спасская церковь считается одной из наиболее старых храмов Полтавы. Первые записи о ней были найдены среди документов Полтавского полка, датированных 1686 г. Возможно, она была боковым пределом (боковой частью) Преображенской церкви, сгоревшей в 1705 г. Священник Иван Свитайло восстановил сгоревший предел церкви из материала разобранного в Крестовоздвиженском монастыре деревянного храма.

По легенде, царь Петр I молился в этой церкви после победы в Полтавской битве 27 июня 1709 г. В 1811 году Преображенская церковь была окончательно разобрана по причине ветхости. Сохранился только боковой предел, как напоминание о ее роли в истории Российской империи. Император Александр II, который посетил Полтаву в 1837 году, осмотрел церковь и, найдя ее пришедшей в большую ветхость, пожертвовал около 2000 рублей на ее ремонт. Позднее дворяне Полтавской губернии собрали около 25000 рублей. Несколько позднее, в 1847 году возле церкви была построена и освящена колокольня. С 1875 по 1898 гг. она была полковой церковью 33-го пехотного полка, который в это время располагался в Полтаве. В 1902 году был произведен ее капитальный ремонт.

Судьба этой церкви не была столь трагичной, как у большинства полтавских храмов, стертых с лица земли в 30-е годы XX столетия. До революции 1917 года в Полтаве было около 20 церквей, из которых уцелело только четыре. Среди них была и Спасская церковь.